Detecção de mutações relacionadas a droga resistência no gene gyrB do Mycobacterium leprae

No Mycobacterium leprae (M. leprae) a resistência aos antimicrobianos dapsona (DDS), rifampicina (RIF) e ofloxacina (OFLO) se dá, primariamente, pela ocorrência de mutações em sequências conservadas dos genes folP1, rpoB e gyrA. Na rotina do Instituto Lauro de Souza Lima, muitos pacientes que apresentam clínica compatível com recidiva a qual poderia estar associada a resistência, apresentam perfil de suscetibilidade sensível a DDS, RIF e OFLO pelos mecanismos conhecidos. Existem vários outros mecanismos de resistência, bem como outros genes que podem ser pesquisados. Na rede de vigilância de resistência no Brasil, para fluorquinolonas, apenas as mutações em gyrA são pesquisadas na rotina, e, portanto, não temos dados sobre mutações em gyrB. No gene gyrB as mutações nos códons 214 (Val214Gly), 464 (Asp464Asn) e 503 (Thr503Ile) foram associadas com resistência à OFLO em M. leprae. O objetivo deste projeto é a detecção de mutações em gyrB por sequenciamento direto de DNA genômico de M. leprae. Para isso, foram utilizadas 52 amostras de DNA do banco de amostras do ILSL selecionadas entre julho de 2021 a dezembro de 2023, as quais já foram testadas por sequenciamento direto na rotina de investigação de resistência em hanseníase do ILSL para mutações já descritas. Foram utilizados dois pares de primers para amplificar e sequenciar as amostras pela metodologia de sequenciamento Sanger. As sequências foram analisadas utilizando-se o software Mega11. O Par 1, o qual permite avaliar polimorfismo no códon 214, enquanto que o Par 3, nos códons 464 e 503. As amostras eram em maioria (53,84%) do sexo masculino, 92,19% maiores de 20 anos com média da idade de 51 anos. Procedentes de vários estados brasileiros, com destaque para SP e MT. Cerca de 92,30% dos casos (48/52) eram multibacilares e 51,92% das amostras provenientes de pacientes com hanseníase virchowiana (MHV). Do total de casos, 55,70% foram associados a situações de falência terapêutica, seguida por casos novos, 19,23% e 11,54% de casos de recidiva da doença. A maioria (59,61%) fez PQT/MB, destes cerca de 74,19% trataram por 24 meses. O sequenciamento do gene gyrB pelo Par 1 foi eficiente em aproximadamente 98,07% dos isolados de M. leprae e pelo Par 3, 69,23%. Entretanto, nenhuma amostra foi polimórfica no gene gyrB e uma amostra apresentou polimorfismo não relacionado a droga resistência no códon 207 (Ile207Ile). Nossos resultados corroboram com a literatura, mostrando que mutações em gyrB é pouco frequente em M. leprae.

English abstract: 

In Mycobacterium leprae (M. leprae), resistance to the antimicrobials dapsone (DDS), rifampicin (RIF), and ofloxacin (OFLO) primarily occurs due to mutations in conserved sequences of the folP1, rpoB, and gyrA genes. In the routine at the Lauro de Souza Lima Institute, many patients showing symptoms compatible with relapse, potentially associated with resistance, exhibit susceptibility profiles to DDS, RIF, and OFLO through known mechanisms. Numerous other resistance mechanisms and genes remain unexplored. In the Brazilian resistance surveillance network for fluoroquinolones, only gyrA mutations are routinely investigated, leaving a gap in data regarding gyrB mutations. Mutations at codons 214 (Val214Gly), 464 (Asp464Asn), and 503 (Thr503Ile) in the gyrB gene have been associated with OFLO resistance in M. leprae. The aim of this project is to detect gyrB mutations through direct genomic DNA sequencing of M. leprae. For this purpose, 52 DNA samples from the ILSL sample bank, selected between July 2021 and December 2023, were utilized. These samples had previously undergone routine direct sequencing at the ILSL for known mutations. Two primer pairs were employed to amplify and sequence the samples using Sanger sequencing methodology. Sequences were analyzed using Mega11 software. Primer 1, assessing polymorphism at codon 214, and Primer 3, targeting codons 464 and 503. The majority of samples (53.84%) were male, with 92.19% over 20 years old and an average age of 51 years. Originating from various Brazilian states, notably SP and MT, approximately 92.30% of cases (48/52) were multibacillary, and 51.92% of samples were from patients with virchowian leprosy (MHV). Among the cases, 55.70% were associated with therapeutic failure, followed by new cases (19.23%) and relapse cases (11.54%). The majority (59.61%) underwent PQT/MB treatment, with around 74.19% treated for 24 months. Sequencing of the gyrB gene using Primer 1 was effective in approximately 98.07% of M. leprae isolates, while Primer 3 showed efficiency in 69.23%. However, no sample exhibited polymorphism in the gyrB gene, and one sample presented non-drug resistance-related polymorphism at codon 207 (Ile207Ile). Our results align with the literature, demonstrating that gyrB mutations are infrequent in M. leprae.